桔青霉素(CTN)酶联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

1使用目的：

本试剂盒用于红曲等样本中桔青霉素(CTN)残留的定量检测。

2实验原理

本试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有桔青霉素(CTN)偶联抗原，加入桔青霉素(CTN)标准品或样品，游离桔青霉素(CTN)与微孔条上预包被的桔青霉素(CTN)偶联抗原互相竞争抗桔青霉素(CTN)抗体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中桔青霉素(CTN)含量成反比，通过标准曲线计算样品中桔青霉素(CTN)的含量。  

3试剂盒组成

3.1预包被的桔青霉素(CTN)偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。
3.2桔青霉素(CTN)标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0ng/ml, 0.025ng/ml,0.1ng/ml,0.25ng/ml,1ng/ml,4ng/ml

3.3抗桔青霉素(CTN)抗体酶结合物：1瓶（6ml）。
3.4显色液A：1瓶（6ml）。
3.5显色液B：1瓶（6ml）。
3.6终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7样本稀释液：1瓶（10×,  6ml），用于样品稀释用。
3.8浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9说明书一份。

4需要而未提供的材料
4.1设备
4.1.1波长450nm酶标仪。
4.1.2粉碎机。
4.1.3量筒。
4.1.4振荡器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。
4.1.7微量移液器。
4.2试剂
4.2.1去离子水或蒸馏水。
4.2.2甲醇。
5贮存
5.1试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻
5.2未用完的微孔板应该密封干燥保存
6注意事项
6.1使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
6.2不要使用过期试剂盒。
6.3试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。
6.4标准品中含有桔青霉素(CTN)，使用时应特别注意，操作时应带手套。
6.5终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。
6.6不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。
6.7不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。
6.8稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果
6.9混合试剂时应避免起泡。
7工作液准备
7.1桔青霉素(CTN)标准品溶液：0ng/ml, 0.025ng/ml,0.1ng/ml,0.25ng/ml,1ng/ml,4ng/ml

7.2浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用

7.3样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用
7.3显色剂：已备用，避免光线直照
7.4反应终止液：已备用
8样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）
8.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液
8.2强力振荡3分钟
8.3用Whatman No 1滤纸过滤
8.4取25μl处理后的样品，加入25μl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2）

9酶免分析步骤
9.1实验须知
9.1.1实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。
9.1.2使用后请立即将试剂放回2~8℃保存
9.1.3请不要改变分析程序
9.1.4请使用精确的微量移液器
9.1.5操作一旦开始，请不要中断任何程序
9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作
9.1.7为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样
9.1.8加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面
9.2分析步骤
9.2.1预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测
9.2.2取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)
9.2.4在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml标准品溶液
9.2.5在各标准孔中加入50μl的标准品溶液
9.2.6在各样品孔中加入50μl样品溶液
9.2.7在所有孔中加入50μl的抗桔青霉素(CTN)抗体酶结合物
9.2.8轻轻晃动反应板几秒钟。
9.3 37℃温浴30min（温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）
9.3.1甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
9.4反应
9.4.1洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl显色液A，再加50μl显色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀
9.4.2 37℃温浴10min
9.4.3每孔中加入50μl终止液，混匀
9.4.4在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。
10结果计算
10.1定量分析
10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B―标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0―0μg/L标准溶液的平均吸光度值
10.1.2以桔青霉素(CTN)浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为桔青霉素(CTN)浓度的对数值，求得反对数即为测定液中桔青霉素(CTN)浓度C（ng/ml）
10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。
10.2半定量测定
10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。

11特异性
物质 交叉反应
桔青霉素(CTN) 100%

12试剂盒参数
本试剂盒检测下限为0.05 ng/ml
B0吸光度最佳值应大于1.0
试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。
用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。
13
试剂盒提供的标准曲线范围为0ng/ml~4ng/ml。

14分析限制
本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。