| 货号 | 34366 | ||||||||||||||
| 简介 | 去除TAGZyme pQE载体表达蛋白N端的His标签 | ||||||||||||||
| 描述 | Performance 对于TAGZyme pQE 载体表达的蛋白，TAGZyme DAPase Enzyme可高效依次去除其N端His 标签与“终止位点”间的二肽（参见 "Efficient His-tag removal"）。通过逆向金属螯合亲和层析可从反应液中获得真正的目的蛋白。由于TAGZyme DAPase Enzyme的C 端带有不可切割的His 标签，它和未处理的His标记重组蛋白能被高效去除。Principle His标签重组蛋白是研究蛋白结构和功能的重要工具。His标签片段较小并具有较低的免疫原性，通常不需要被去除。但是，不确定来源氨基酸的蛋白产物更适用于一些应用，例如通过X射线或NMR进行结构研究，或治疗性蛋白的合成。 TAGZyme体系可特异并高效去除重组蛋白N端的His标签。DAPase酶用于依次切割纯化的His标签蛋白N端的二肽（参见"His-tag removal"）。当酶切割到“终止位点”时，消化就会停止，终止位点是一个不能作为底物的氨基酸基序（见表“DAPase终止位点”）。如果一个重组蛋白自身不含有DAPase终止位点，可通过在载体上插入谷氨酰胺密码子来引入。在被表达的蛋白中，谷氨酰胺变成焦谷氨酸，成为DAPase酶的终止位点。
Procedure 使用TAGZyme pQE-2载体表达的自身含有终止位点的重组蛋白，无论DNA插入位点如何，都可完全高效地去除其N端His标签。使用 DAPase孵育后，反应液加入到Ni-NTA基质中进行逆向金属螯合亲和层析（IMAC)（参见 "Purification of detagged proteins"）。His标记片段和TAGZyme DAPase酶（C 端带有不被切割的His标签）与基质结合，从流出液中可回收到纯化的无带标签目的蛋白。 当蛋白自身不含有DAPase终止位点时，可通过表达载体插入谷氨算密码子，从而向蛋白序列中引入终止位点。TAGZyme pQE-1载体可在His标签序列和蛋白序列之间编码一个谷氨酸残基，从而配合TAGZyme体系发挥作用。谷氨酸残基位于His标签后的奇数位位点，恰位于原始蛋白第一个氨基酸之前。使用DAPase和过量的Qcyclase可去除His标签。通过DAPase去除His标签二肽后，谷氨酸残基暴露在N端。反应液中过量的Qcyclase能将N端的谷氨酸残基催化形成焦谷氨酸端含有焦谷氨酸的二肽不能作为DAPase的底物，从而终止进一步的切割。反应液进行一轮逆向IMAC，His标签TAGZyme DAPase和Qcyclase酶就能被去除。在流出液中可收集到目的蛋白。目的蛋白N端的焦谷氨酸残基可被His标签pGAPase去除，pGAPase 能被第二轮逆向IMAC去除，在流出液中即可获得纯化的无标签目的蛋白。 Applications TAGZyme体系提供特异性切割、重组试剂和污染物的完全去除，是制备不含His标签蛋白的理想选择，适用于多种应用：
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| 说明书 |
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| 供应商 | Qiagen |