| 货号 | 32932 | ||||||||||||||
| 简介 | 表达通过TAGZyme酶去除His标签的重组蛋白 | ||||||||||||||
| 描述 | Performance TAGZyme DAPase Enzyme可有效去除His标签N端到“终止位点”间的肽，蛋白可由TAGZyme pQE载体表达（参见"Efficient His-tag removal"）。当谷氨酰胺残基作为终止位点时，可被DAPase-Qcyclase和pGAPase的共同作用去除。通过消减IMAC可从反应液中获得真正的目的蛋白。由于TAGZyme DAPase Enzyme、Qcyclase和pGAPase 酶自身C 端带有6xHis标签，它们和未处理的His-tagged重组蛋白能被有效去除。Principle His-tagged重组蛋白是研究蛋白结构和功能的重要工具。His标签很小并具有较低的免疫原性，使它通常不需要被去除。但是，不含有载体来源氨基酸的蛋白产物更适用于一些应用，例如通过X射线或NMR进行结构研究，或生产具有治疗效果的药物。 TAGZyme pQE载体都含有多克隆位点，用于表达能被DAPase消化的N端6xHis-tagged蛋白（参见"Features of the TAGZyme pQE-1 and pQE-2 vectors"）。T5-启动子转录-翻译体系在E. coli中有很高表达水平。TAGZyme pQE-2载体适用于表达自身不含有DAPase终止位点的蛋白。表达不含有终止位点的蛋白，使用TAGZyme pQE-1载体可在His标签序列和蛋白序列之间编码一个谷氨酰胺残基，在过量Qcyclase酶作用下变为焦谷氨酸，形成DAPase终止位点。 TAGZyme体系从重组蛋白上去除N端His标签，具有很高的特异性和效率。DAPase，酶用于切割纯化His-tagged蛋白N端肽（参见"His-tag removal"）。当酶切割到“终止位点”时，消化就会停止，终止位点是一个不能作为底物的氨基酸基序（见表“DAPase终止位点”）。如果重组蛋白自身不含有DAPase终止位点，可通过在载体上插入谷氨酰胺密码子来引入。在表达的蛋白中，谷氨酰胺变成焦谷氨酸，成为DAPase酶的终止位点。
Procedure 使用TAGZyme pQE-2载体表达自身含有终止位点的重组蛋白，不管DNA片段插入位点如何，都可完全、有效地去除N端His标签。使用DAPase酶孵育后，反应液加入到Ni-NTA基质中进行消减固定金属亲和层析色谱（IMAC)（参见"Purification of detagged proteins"）。His标签片段和TAGZyme DAPase酶（C 端带有未切割的His标签）与基质结合，在穿透液中可回收到纯化的、无标签的目的蛋白。 当蛋白自身不含有DAPase终止位点时，可通过表达载体插入谷氨酰胺密码子，从而向蛋白序列中引入终止位点。TAGZyme pQE-1载体可在6xHis标签序列和蛋白序列之间编码一个谷氨酰胺残基，可配合TAGZyme体系发挥作用。谷氨酰胺残基位于His标签后的奇数位位点，正好在原始蛋白第一个氨基酸之前。使用DAPase酶和过量的Qcyclase酶可去除His标签。通过DAPase酶去除His标签肽后，谷氨酰胺残基暴露在N端。反应液中过量的Qcyclase酶能将N端的谷氨酰胺残基催化形成焦谷氨酸。N端含有焦谷氨酸的肽不能作为DAPase的底物，进一步的切割就被终止了。反应液进行一轮消减IMAC，His-tagged TAGZyme DAPase和Qcyclase Enzymes就能被去除。在穿透液中可收集到目的蛋白。目的蛋白N端的焦谷氨酸残基可被6xHis-tagged pGAPase酶去除，pGAPase酶能被第二轮消减IMAC去除，在穿透液中即可获得纯化的、无标签的目的蛋白。 Applications TAGZyme体系提供特异性切割，重组试剂的使用以及完全去除污染物，使其成为获得不含His标签蛋白的理想选择，适合的应用包括：
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| 说明书 |
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| 供应商 | Qiagen |