从稳定于PAXgene Blood RNA Tubes的全血中分离和纯化胞间RNA

Performance

PAXgene Blood RNA Tubes适用于采集全血并稳定细胞内RNA，在18–25°C条件下可稳定长达3天（参见"RNA stability at 18–25°C: FOS"和"RNA stability at 18–25°C: IL1B"），或在2–8°C条件下稳定长达5天（参见"RNA stability at 2–8°C: FOS"和"RNA stability at 2–8°C: IL1B"）。当前的数据显示，细胞内RNA在–20°C或–70°C条件下可保存至少60个月。

使用PAXgene Blood RNA System纯化的总RNA纯度高，A₂₆₀/A₂₈₀ 值在1.8和2.2之间，且基因组DNA含量不超过1.0% (w/w)。当使用30%的洗脱液时，至少95%的样品在RT-PCR中没有出现反应抑制的情况。

样品制备的平均时间为90分钟（根据12个样品的制备时间），手工操作只需40分钟。在处理95%以上样品时，2.5 ml健康人类全血的RNA产量不低于3 µg。由于产量高度依赖于供体，单次产量可能会有变动。对于单个供体，PAXgene Blood RNA System 确保产量可重复性高（参见Reproducible and repeatable RNA purification"和"Repeatability and reproducibility of RNA yield"）以及RT-PCR的可重复性高（参见"Reproducibility between users"、"Reproducibility between kit lots", 和表格），高度适合于临床诊断检测。

对于超过95%的样本，从2.5 ml健康人类全血中获得的RNA产量不少于3 μg。图片"RNA yield and purity — automated processing"显示的是3名实验员使用3批试剂盒自动化处理288个样本的RNA产量。由于使用的是混合血液样本而非单个的PAXgene Blood RNA Tubes，实验结果不能反映单一个体血液样本的RNA预期产量。由于产量高度依赖于供体，单个产量会有差别。

当使用多至30%的洗脱液时，至少95%的样品不会出现RT-PCR抑制。通过对RNA阴性样品（水）中beta-球蛋白和FOS转录子序列与RNA阳性样本（人类全血）进行定量RT-PCR分析，未发现使用自动化流程处理样品中有交叉污染。

使用PAXgene Blood RNA System的自动流程制备的RNA纯度高，没有RT-PCR抑制（见上文），A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8 和2.2之间。经real-time PCR分析beta-肌动蛋白的序列发现，超过95%的样品的基因组DNA含量不高于1% (w/w) 。图片"RNA yield and purity — automated processing"显示了3个实验员使用3批试剂盒处理288个样品的A₂₆₀/A₂₈₀值和相对基因组DNA含量。

如图"Reproducibility between automated and manual protocols"所示，使用PAXgene Blood RNA System自动纯化RNA的流程提供高度可重复的RT-PCR结果，适用于临床诊断检测。

Principle

PAXgene Blood RNA Kit用于从在PAXgene Blood RNA Tube中采集的2.5 ml人类全血中纯化总RNA，操作简单，可手工操作，也可自动化运行（参见"Manual PAXgene Blood RNA procedure"和"Automated PAXgene Blood RNA procedure"）。

PAXgene Blood RNA Tubes 含有专利申请中的特定试剂，基于RNA固定的专利技术（US Patents 6,602,718 和6,617,170）。这些试剂成分可保护RNA分子，避免其被RNA酶降解，并将基因表达体内变化的改变降至最小。PAXgene Blood RNA Tubes适用于采集全血并稳定细胞内RNA，在18–25°C条件下可稳定长达3天（参见"RNA stability at 18–25°C: FOS"和"RNA stability at 18–25°C: IL1B"），或在2–8°C条件下稳定长达5天（参见"RNA stability at 2–8°C: FOS"和"RNA stability at 2–8°C: IL1B"）。当前的数据显示，细胞内RNA在–20°C或–70°C条件下可保存至少60个月。

Procedure

PAXgene Blood RNA纯化操作流程简单，可手动或自动进行（参见"Manual PAXgene Blood RNA procedure"和"Automated PAXgene Blood RNA procedure"）。

PAXgene Blood RNA纯化手动流程

将重悬的沉淀和蛋白酶K一起溶解在经优化的缓冲液中孵育，进行蛋白质酵解。然后应用PAXgene Shredder离心柱再次离心，匀浆细胞裂解液，并去除剩余的细胞残骸。将流过部分的上清液转移到干净的微型离心管中，加入乙醇调节结合条件，将裂解液装入一个PAXgene RNA离心柱中。快速离心后，RNA会选择性地结合到PAXgene硅胶膜上，杂质则流过。剩余的杂质通过几次高效洗涤去除。在第一次和第二次洗涤步骤之间，使用DNA酶处理膜，以去除微量残余的DNA。洗涤之后，使用洗脱缓冲液洗脱RNA并进行热变性。

PAXgene Blood RNA纯化自动流程

使用QIAcube全自动核酸纯化仪制备样品的流程与手动法相同，您可继续使用PAXgene Blood RNA Kit纯化高品质RNA。

自动化的RNA纯化流程由两个部分组成，"PAXgene Blood RNA Part A"和"PAXgene Blood RNA Part B"，在两个部分之间需要短暂的手工操作。

将经离心、洗涤、重悬的核酸沉淀从PAXgene Blood RNA Tube转移到离心管中，将离心放到QIAcube全自动核酸纯化仪工作台的恒温震荡器中。实验员选择并启动菜单中的"PAXgene Blood RNA Part A"。QIAcube全自动核酸纯化仪会自动运行，直到将RNA洗脱至洗脱缓冲液中。实验员将含有已纯化RNA的离心管转移到QIAcube全自动核酸纯化仪的恒温震荡器中，选择并启动菜单中的"PAXgene Blood RNA Part B"，QIAcube全自动核酸纯化仪会执行热变性。

样本平均制备时间是125分钟（基于制备12个样本的时间），手工操作时间只需约20分钟。

Applications

该试剂盒与PAXgene Blood RNA Tubes共同使用，可从全血中分离纯化细胞内RNA进行RT‑PCR。