用于人类、小鼠、大鼠和狗miRNA的real-time PCR实验结果标准化

Performance

miScript Primer Assays设计用于大量的ncRNAs，评估不同类型细胞和组织中靶向ncRNAs的扩增效率和表达水平变化。miScript PCR Controls根据人类、小鼠、大鼠和狗ncRNAs的序列保守性而设计，可用于这4个物种。6个ncRNAs的miScript Primer Assays作为miScript PCR Controls。它们满足下面的条件：

内参ncRNA靶基因在多种细胞和组织中，表达水平相对稳定（参见"Constant expression levels of RNAs targeted by miScript PCR Controls"）

标准条件下，扩增效率接近100%

在人类、小鼠、大鼠和狗中性能相同，同一内参可用于4个物种，可灵活使用

Principle

为确保miRNA定量PCR分析获得准确、可重复性的结果，必须通过使用合适的内参RNA对靶基因miRNA的量进行标准化，这就是相对定量分析。这是一种重要的参照照，可校正那些可能导致定量不准确的因素。这些因素包括使用的RNA数量的不同、RNA降解的可能性或RNA样本中出现抑制剂和样本处理的差异。标准化也可用于不同实验和样本结果的直接对比。

良好的内参

miRNA 定量PCR实验中，标准化数据的理想内参RNA应具有以下特性：

研究中所有样本应保持稳定的表达水平

与正在研究的miRNA大小相似

具与正在研究的miRNA样本表达水平类似

在实验条件下不被调控

内参RNA和miRNA的引物具有相近的扩增效率（接近100%)

miScript PCR Controls符合上述条件，可在miScript PCR System上用ΔΔC_T方法进行人类、小鼠、大鼠和狗在miRNA水平的相对定量计算。

miScript PCR Controls靶向作用于非编码RNAs

QIAGEN提供一系列的miScript Primer Assays靶向ncRNAs如snoRNAs和snRNAs。QIAGEN技术人员系统评估了用于多种ncRNA的一系列miScript Primer Assays，并选择了6个miScript PCR Controls，5个snoRNAs和一个snRNA（参见下表）。这些内参也存在于每个miScript miRNA PCR Array中（参见"miScript miRNA PCR Array layout for 96-well plates"）。

注意：miScript II RT Kit包含2种缓冲液：miScript HiFlex Buffer和miScript HiSpec Buffer。下面是以前的miScript PCR Controls不能与使用miScript HiSpec Buffer制备的cDNA一起使用：
Hs_RNU1A_1 miScript Primer Assay
Hs_RNU5A_1 miScript Primer Assay
Hs_SNORD25_1 miScript Primer Assay
Hs_SCARNA17_1 miScript Primer Assay
Hs_SNORA73A_1 miScript Primer Assay
如需使用这些miScript PCR Controls，应使用miScript HiFlex Buffer制备cDNA。

如需使用miScript HiSpec Buffer或miScript HiFlex Buffer制备cDNA，推荐使用上述表格中列出的miScript PCR Controls。

Procedure

怎样选择miScript PCR Controls

为miRNA定量分析选择合适的miScript PCR Control，类似于为mRNA定量分析标准化选择合适的管家基因。对研究中的不同样本类型和不同的处理，有必要验证miScript PCR Control的靶向ncRNA在实验条件下不被调控。另外，要选择表达水平稳定和与miRNA靶基因丰度相似的miScript PCR Control。miScript PCR Control可在GeneGlobe Web门户网站上单独订购。同时提供全套的miScript miRNA PCR Arrays和miScript miRNA QC PCR Arrays。

ΔΔC_T法用于相对定量

ΔΔCT法通常用于在miScript PCR System中进行相对定量。该方法主要是比较正常的C_T值和实验样本C_T值的差异。使用miRNA靶基因的引物(miScript Primer Assay)进行Real-time PCR，同时使用miScript PCR Control检测snoRNA或snRNA。miScript PCR Control得到的循环阈值（C_T）用于标准化数据，如下所示。

首先，确定每个样本的循环阈值（C_T）。然后，计算ΔC_T。ΔC_T即miRNA靶基因的C_T值与内参ncRNA的C_T值之差：
ΔC_T= C_T（miRNA靶基因）- C_T（内参ncRNA）

下一步，计算ΔΔC_T值和标准靶基因的表达：
ΔΔC_T = ΔC_T（样本[ 如疾病细胞]）- ΔC_T（校准值[如正常细胞]）
样本中标准miRNA靶基因的表达= 2^-ΔΔC_T

最后，校准器中的标准表达水平设置为100%：
% 表达值的变化=（样本中标准miRNA靶基因的表达值x 100)% - 100%

miScript miRNA PCR Array数据分析

miScript miRNA PCR Array 数据分析工具，使用相对定量的∆∆C_T法自动完成定量和进行内参分析。结果以表格、散点图、三维谱分析图和火山图（包括复本）的形式呈现。可单独订购其它分析工具，用于不同的miScript miRNA PCR Array，还可使用Web-based或Excel格式。

Applications

miScript PCR Controls适用于miRNA定量和表达谱分析